来自II型CRISPR-Cas细菌适应性免疫系统的CRISPR-Cas9已被设计为包括植物在内的多种生物体的有效基因组编辑工具。然而广泛使用的SpCas9主要识别5’-NGG-3’ PAM的特性限制了可编辑范围，特别是在A/T富集的启动子等调控序列及非蛋白编码RNA序列的有效编辑。近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由西南大学张勇课题组及其合作团队撰写的“Expanding plant genome editing scope and profiles with CRISPR-FrCas9 systems targeting palindromic TA sites”论文。该研究针对来源于Faecalibaculum rodentium的可识别5’-NNTA-3’ 回文PAM基序的CRISPR-FrCas9植物基因组编辑新系统，构建了高活性、高特异性且识别A/T富集PAM的植物基因组编辑新工具，扩大了植物基因组编辑范围，并在此基础上进行了有效的植物蛋白编码基因敲除编辑、启动子调控编辑、microRNA敲除编辑。全文主要研究结果如下：
FrCas9在植物基因组编辑中的特性分析
与SpCas9相比，FrCas9的回文5’-NNTA-3’ PAM会增加sgRNA分布的密度（图1 a-c），在水稻基因组编码及非编码区，FrCas9比SpCas9可以设计更多的靶位点（图1 d）。作者测试了不同的sgRNA scaffold对于FrCas9编辑活性的影响，截短了4bp的sgRNA V02表现出最高的编辑活性（图1 e-f）。进一步，作者探究了FrCas9系统在水稻内源基因位点的编辑效率，经原生质体转化、扩增子测序结果表明，FrCas9在所选择的16个位点中均表现出了较高的编辑活性（图1 g）。同时，FrCas9在编辑点主要引起的插入多于删除（图1 h），删除主要发生在FrCas9切割位点周围（图1 i），主要产生1bp删除（图1 j），插入主要发生在PAM周围（图1 k），主要产生1bp插入（图1 l）。
图1 CRISPR-FrCas9在植物基因组编辑中的特性研究
FrCas9在水稻稳定植株中的高效编辑
进一步测试FrCas9系统在水稻稳定转化植株中的编辑能力，作者在水稻T0代植株中应用FrCas9实现了有效的基因编辑，在所有测试的位点都可以获得突变的T0代植物，突变效率为10%-85.7%；在测试的6个位点中，有5个位点有双等位基因突变，双等位突变编辑效率为35%-80.7%（图2 a-b）。对FrCas9在OsGn1a和OsGS3基因编码区域产生的编辑植株进行了进一步研究，OsGn1a双等位基因突变体都显示出每穗粒数和每穗一级分枝数增加（图2 c-f）；OsGS3双等位基因突变体都显示出种子长度增加，但种子宽度或种子厚度没有增加（图2 g-k）。
图2 CRISRP-FrCas9在水稻稳定植株中的高效基因组编辑
TREX2-FrCas9在不影响编辑效率的情况下实现多碱基删除编辑
FrCas9主要产生1bp的插入或者删除，这种小的InDel可以在蛋白质编码基因中产生敲除，但它们在编辑非编码基因（如微小RNA）或非编码区域（如顺式调节元件）方面不能发挥强大的作用。作者将三引物修复核酸外切酶2（TREX2）与FrCas9的N末端融合（图3 a），将TREX2-FrCas9与野生型FrCas9在水稻原生质体中的18个内源靶位点进行比较。结果显示，TREX2-FrCas9不影响编辑效率（图3 b），通过比较18个水稻内源位点的缺失谱，发现FrCas9主要产生1bp的删除，其次是2bp的删除（图3 c）。相比之下，TREX2-FrCas9产生了6bp-10bp或更长的删除，并且删除大小在16bp-20bp处达到峰值（图3 c）。此外，FrCas9在不同靶位点产生不同水平的插入和删除（图3 d），但在TREX2-FrCas9编辑的靶位点中几乎没有任何可检测的插入（图3 e）。
图3 TREX2-FrCas9在不影响编辑效率的情况下生成更大的删除
TREX2-FrCas9介导的OsMIR156j有效删除编辑
为了进一步测试了TREX2-FrCas9系统的多碱基删除能力。作者在水稻T0代植株中应用TREX2-FrCas9实现了有效的OsMIR156j编码区域多碱基删除编辑（图4 a-d），并在双等位基因删除的株系中进一步考察了OsMIR156j二级结构的变化（图4 e），OsMIR156j-5p/3p表达量的改变（图4 f），OsSPL家族部分基因的表达量的变化(图4 g），明确了TREX2-FrCas9系统作为miRNA突变体创制工具的可行性。
图4 TREX2-FrCas9介导的OsMIR156j有效删除编辑
基于FrCas9的胞嘧啶碱基编辑器及腺嘌呤碱基编辑器
基于对应于SpCas9切口酶（D10A）的FrCas9切口酶（D20A）、在哺乳动物中具有有效碱基编辑活性的FrCas9切口酶（E796A）、不同类型的胞嘧啶脱氨酶，作者在水稻中开发了不同版本的胞嘧啶碱基编辑器，实验结果表明FrCas9 CBE V2.1可以在水稻中实现高效的C-to-T碱基编辑（图5）。
图5 基于FrCas9的胞嘧啶碱基编辑器提供有效的C-to-T碱基编辑
基于FrCas9切口酶（E796A）及腺嘌呤脱氨酶，作者在水稻中开发了腺嘌呤碱基编辑器，实验结果表明FrCas9 ABE可以在水稻中实现有效的A-to-G碱基编辑（图6）。
图6 基于FrCas9的腺嘌呤碱基编辑器提供有效的A-to-G碱基编辑
FrCas9编辑器的全基因组脱靶分析
运用WGS全基因组评估水稻FrCas9及TREX2-FrCas9系统的脱靶效应，选择18个水稻独立单株进行全基因组测序及分析（图7 a-b）。结果表明：与对照植物相比，FrCas9系统的InDel和SNV数量没有显著差异（图7 c-d）；TREX2-FrCas9系统的InDel数量没有显著差异，SNV数量显著增加且主要为C:G>T:A和A:T>T:A（图7 c-f），所有SNV在基因组上随机分布（图7 g）。对所有植株的sgRNA依赖性脱靶位点进行检测，结果表明，这些sgRNA依赖性脱靶位点均没有发生突变（图7 h）。
图7 FrCas9编辑器的全基因组脱靶分析
电子科技大学博士生何瑶、西南大学博士生韩阳朔为论文共同第一作者。西南大学必赢nn699net张勇教授、扬州大学张韬教授及马里兰大学Yiping Qi教授为论文共同通讯作者。该研究受STI 2030重大项目、国家自然科学基金面上项目等资助。
论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.14363
